马皇后成为正宫皇后后，勤于内治。在对后宫的管理上，她经常借鉴宋朝的许多贤德皇后，并将其家法摘录下来，经常翻阅查看。有人说，宋朝的皇后太过仁厚了吧？马皇后反问道：“难道仁厚不好吗？与刻薄相比，总要好得多吧？”马皇后对娘家人极为怀念，每当说到父母早逝就痛哭流涕，朱元璋也因关心她而及于外家，要为马皇后访察亲属，以便封赏。马皇后却拒绝访找，认为封外戚容易乱政，还是不找为好。实际上，马皇后娘家已经没有人了，朱元璋只好追封马公为徐王，郑媪为王夫人，在宿州为他们设立祠祭署，以邻居王姓主持奉祀的事。马皇后说：“我家亲属中未曾见有可用人才，况且这样做也不合法。如果不是人才却授其官职，骄淫不法，恃宠致败，这不是我所期愿的。”
马皇后对子女的管教也非常严厉，她的小儿子朱肃平时放荡不羁，被封为周王。到开封赴任前，马皇后就让江贵妃随往，并将纰衣与御杖赐于江贵妃，以免朱肃为非作歹无人管教。这样一来，朱肃在开封就收敛多了。
马皇后克服了女人的嫉妒心，对于妃嫔宫人，如有因被皇帝宠爱而生下孩子的，她都非常厚待，并“命其入朝能以礼相待”。同时，马皇后一直保持过去的俭朴作风，平日穿洗过的旧衣服，破了也不忍丢弃。受元世祖的察必皇后煮弓弦织帛衣的启发，她命人在后宫架起织布机，又捡起以往的手艺，亲自织些绸衣料、缎被面什么的，然后以皇家的名义赐给那些年纪大的孤寡老人；而其他料子，则裁成衣裳赐给王妃公主，让她们知道老百姓的不容易，并教导妃嫔不忘蚕桑的艰难。如遇灾年，她便带领宫人去体验民间疾苦，吃一些平民之食。
马皇后与身边的妃子、宫人相处得也非常和睦。马皇后以皇后的身份，还要询问丈夫的饮食，宫女认为她不必这样做，她说这是在尽做妻子的责任，再是怕皇帝饮食有不中意处，怪罪下来，宫人担当不起，她好承受着。朱元璋脾气不是很好，在后宫，常看这个不顺眼，那个也不好。一次，朱元璋盛怒，要立即惩罚一个宫中下人，马皇后也假作发怒，下命令把那人捆绑起来，交给宫正司议问罪。事后朱元璋问其原因，马皇后意味深长地说：“赏罚分明才可以服众，作为治理天下的君主，怎么可能亲自处理每一个人，如果有犯法的就应当交给有关惩部去问罪。皇帝不能因为自己的情绪而奖赏或惩罚，当陛下不高兴之时，一定会给予不公平的惩罚。把他们交给刑部，就能做出公正的判决了。陛下今后要定某人的罪，还是应该移交刑部的。”从这些事都可以看出，马皇后不仅要求丈夫不能因个人喜怒来处罚人，也体现了她对下人的关怀。
