褐变是指在组培过程中，由培养材料使培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。它的发生是由于外植体中的酚类化合物与多酚氧化酶作用被氧化而形成褐色的醌类化合物，醌类化合物在络氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。
一、褐变的原因
1.组培植物种类和品种
木本植物和多年生草本植物易引起褐变。
2.外植体的生理状态和大小
成龄材料一般比幼龄材料褐变严重，小的材料比大的材料容易褐变。
3.取材时间和部位
春季采用生长旺盛部位的外植体发生褐变较轻。
4.培养基成分
液体培养基、低盐培养基、低浓度的细胞分裂素、低pH值外植体褐变程度较轻。
5.培养条件
光照过强、温度过高、培养时间过长均可加剧褐变。
二、防止褐变的措施
1.正确选择外植体
冬春季节选择年龄较小、生长旺盛的外植体材料进行组培，尤其是切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织。
2.选择适宜的培养基
在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂，如抗坏血酸、硫代硫酸钠、有机酸、半胱氨酸及其盐酸盐、亚硫酸氢钠和氨基酸等，使用0.1%～0.5%的活性炭。
3.创造合适的培养条件
外植体接种前将材料或母株枝条进行遮光处理。
4.连续转移
对容易褐变的材料可间隔12h～24h的培养后再转移到新的培养基上。
补血草属蓝雪科多年生或二年生草本植物，因其花朵细小，干膜质，色彩淡雅，观赏时期长，与满天星一样，是重要的配花材料。
补血草属植物一般采用种子繁殖。但补血草属植物的遗传性十分特殊，其花粉有A、B型之别，柱头有玉米状、乳头状和头状之分，其杂交亲和性取决于花粉和柱头的形态组合；同时补血草具有大量的不孕枝和同型杂交不孕的特性，种子结实少，所以补血草若用种子繁殖，种子来源的可靠性就限制了其批量生产。当前，植物组织培养技术已成为植物快速繁殖和作物品种改良的重要手段，为克服种子繁殖所带来的缺点，近年来国内外正在研究采用组织培养方法来繁殖补血草。
（1）材料的选择。选取生长健壮、无病虫害的母株为试验材料。
（2）外植体的选择。以幼嫩叶片为外植体。
（3）外植体的消毒。选取幼嫩叶片，饱和洗衣粉水刷洗表面至表面无明显尘土，然后自来水下冲洗2h。在超净工作台上，垂直叶脉将叶片剪成两半，放入广口瓶中，70%酒精消毒45s～1min，再用0.1%氯化汞溶液消毒5min～6min，无菌水冲洗4次～5次后倒掉最后一次清洗用的无菌水，备用。
三、培养
1.诱导
在超净工作台上将消毒处理之后的外植体用无菌镊子从广口瓶中取出置于无菌滤纸上，让其吸干叶片上多余的水分，将叶片剪成1cm长小段，然后接种在准备好的外植体诱导培养基中（MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值5.8～6.0），将叶片背面接触培养基。培养条件控制在温度25℃±2℃，光照时间12h/d～14h/d，光照强度120μmol·m-2·s-1～200μmol·m-2·s-1，继代周期30d。
2.继代
在诱导培养基上培养30d后，将叶片转入继代培养基中（MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.6mg/L+抗坏血酸200mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值5.8～6.0，继代，将叶片背面接触培养基。培养条件控制在温度25℃±2℃，光照时间12h/d～14h/d，光照强度120μmol·m-2·s-1～200μmol·m-2·s-1，继代周期30d。
3.生根培养
当不定芽长至2cm～3cm时，将其转入生根培养基中进行生根培养，生根培养基为：1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+多效唑0.2mg/L+抗坏血酸200mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值5.8～6.0。培养条件控制在温度25℃±2℃，光照时间12h/d～14h/d，光照强度120μmol·m-2·s-1～200μmol·m-2·s-1。
四、试管苗移栽
当株高长至2.5cm～3.5cm，根长为1cm左右时进行试管苗的移栽。首先，将试管苗连同培养瓶一起移至智能温室，炼苗1周。移栽前1d～2d，打开瓶盖，然后用镊子小心取出试管苗，洗净根部琼脂，用800倍代森锰锌溶液浸泡1min～2min，移栽于128穴盘中，其中基质成分为草炭∶蛭石∶珍珠岩=5∶3∶2，移栽后7d内保持温度25℃±2℃，湿度85%～90%，以后逐渐降低温度和湿度至智能温室内自然状态。移栽后10d在叶面喷施肥0.2%磷酸二氢钾，然后每7d交替喷施0.2%磷酸二氢钾和0.2%尿素。
五、定植
1.规格：长至6片～8片叶片，叶幅8cm～10cm。
2.株行距：35cm×40cm。
3.整地：温室内均匀撒10袋五氯硝基苯、10袋土壤菌虫全杀、20袋烘干鸡粪和2袋二铵后深翻20cm晾晒3d～5d。
4.整畦：3m为一畦。
【思考题】
1.进行补血草组织培养的意义是什么？
2.继代过程中发生褐变现象怎样防止？
3.植物组织培养过程中发生褐变的原因是什么？
4.外植体的选择对褐变现象有什么影响？
